Resumo

Objetivos: A sinalização entre células gliais e neurônios já foi demonstrada em cortes cerebrais e a liberação de gliotransmissores como o ATP pode modular a transmissão sináptica no SNC, inclusive na retina. Astrócitos corticais são capazes de liberar ATP de vesículas acídicas através de um processo dependente de cálcio. Neste estudo, investigamos o efeito da ativação de receptores de glutamato, da despolarização por KCl e do aumento de Ca2+ intracelular sobre a liberação vesicular de ATP em culturas de células de Müller de retina de embrião de pinto. Métodos: A exocitose de vesículas contendo ATP foi estimada usando-se o método de Bodin e Burnstock (J. Cardiov. Pharmacol. 38(6): 900, 2001) modificado. Culturas purificadas de glia, obtidas de retinas de embriões de galinha com 8 dias, foram incubadas, por 5 min, a 37ºC, com quinacrina 5 μM, composto capaz de marcar vesículas acídicas contendo ATP. As culturas foram então lavadas em solução salina, estimuladas e a fluorescência analisada por microscopia. Já o conteúdo de ATP liberado das células foi estimado por luminescência, utilizando o “ATP determination kit” da Invitrogen. Resultados: A marcação com quinacrina revelou vesículas fluorescentes no corpo celular das células de Muller que não puderam ser observadas quando as culturas foram pré-tratadas com 1 M de bafilomicina A1. Enquanto a marcação destas vesículas permaneceu inalterada por pelo menos 10 min em solução de Hanks’, uma diminuição em sua fluorescência foi observada após a adição de KCl 50 mM, Glutamato 1 mM ou Kainato 0.1 mM e incubação das células por 10 min. Em contraste, a adição de NMDA 0.1 mM às culturas induziu apenas uma pequena diminuição na quantidade de vesículas marcadas. Além disto, a diminuição de marcação induzida por glutamato foi inibida por DNQX 50 μM mas não por MK-801 50 μM. A adição de ionomicina 5 μM, um potente ionóforo de Ca2+ também induziu uma redução na marcação das vesículas após 10 min, sendo este efeito bloqueado pela incubação das células com EGTA 1mM. A diminuição de marcação induzida por KCl 50 mM também foi inibida pelo quelante de cálcio interno BAPTA-AM 30 μM. Ensaios de luminescência para detecção de ATP mostraram que KCl 50 mM, glutamato 1 mM e kainato 0,1 mM foram capazes de induzir uma liberação significativa deste nucleotídeo em culturas purificadas de glia (% do controle: KCl = 317 ± 81 %; glutamato = 235 ± 28 %; kainato = 238 ± 40 %; p<0.05, n>3). A incubação com bafilomicina 1 μM e BAPTA-AM 30 μM, assim como a incubação com DNQX 50 μM induziram uma diminuição significativa na liberação de ATP em resposta ao glutamato (% do controle: glutamato + bafilomicina A1 = 92 ± 22 %; glutamato + BAPTA-AM = 71 ± 19 %; glutamato + DNQX = 84 ± 19 %; p<0.05, n=3). Conclusões: Estes resultados sugerem que células gliais de retina em cultura apresentam vesículas contendo ATP que podem ser liberadas por estimulação de receptores glutamatérgicos ou despolarização por KCl, sendo esta liberação dependente de Ca2+. Ambos os receptores ionotrópicos glutamatérgicos induzem a liberação do conteúdo das vesículas. Os receptores não-NMDA, no entanto, parecem ser os principais receptores envolvidos na liberação de ATP.