Resumo

A deficiência de tiamina está associada com vários distúrbios clínicos, como o beribéri, e neuropsiquiátricos, como a Encefalopatia de Wernicke. Apesar das evidencias da importância da tiamina na fisiologia do Sistema Nervoso Central (SNC), os mecanismos relacionados às funções especificas dessa vitamina no cérebro e as suas relações com aspectos comportamentais continuam obscuras. O conhecimento sobre a concentração de tiamina em diferentes amostras biológicas permite ampliar a investigação sobre o papel dessa vitamina no SNC, avaliar as conseqüências da sua deficiência e, portanto, contribuir para a compreensão dos substratos biológicos associados a disfunções neuropsiquiátricas. Os objetivos do presente trabalho foram estabelecer um protocolo único para dosagem da tiamina e de seus fosfatos, por cromatografia liquida de alta performance–HPLC, com detecção fluorométrica e; ajustar as condições para processamento de amostras de leite materno e sangue humano, bem como sangue e regiões do cérebro de ratos. Amostras de 500 µL de sangue ou 9 mL de leite materno foram tratadas com ácido tricloroacético (TCA) 10% p/v ou 50% p/v, respectivamente, e centrifugadas a 10000 rpm por 15 min, para precipitação das proteínas. Amostras de hipocampo ou tálamo foram homogeneizadas com TCA 10% na proporção 1:15 e centrifugadas a 10000 rpm por 15 min. Ferricianeto de potássio alcalino foi utilizado para derivatização da tiamina e seus fosfatos em tiocromo fluorescente. A separação foi realizada por cromatografia de fase reversa, coluna C18, em diluição isocrática com tampão fosfato 0,05M, pH 7,0 e metanol 30% a 1,0mL/min. Duzentos microlitros de sobrenadante foram injetados e as condições de detecção foram de excitações e emissões de 365nm e 435nm, respectivamente; ganho: 4; tempo de resposta 1,5 e taxa: 1x. Com essas variáveis definidas foi possível detectar uma concentração média de 4ng/mL de tiamina em amostras de sangue humano. A tiamina foi separada de suas formas fosforiladas em tempos médios de retenções de 8,3 +/- 0,2 min e 4,4 +/- 0,2 min, respectivamente. Concluímos que as condições estabelecidas para o processamento das amostras biológicas, separação e quantificação cromatográfica, permitem a utilização de um protocolo único, rápido e relativamente econômico, para dosagem da tiamina e de seus fosfatos em amostras de leite materno, sangue humano e tecido cerebral e sangue de roedores. Apoio Financeiro: FAPEMIG Apoio Técnico: Aparecida Guerra de Jesus