Resumo

PALAVRAS-CHAVES: Glutamato, CLAE, retina OBJETIVO: A avaliação da captação de glutamato no Sistema Nervoso Central (SNC) é de fundamental importância para diversos estudos em neurociência. Neste contexto, as metodologias utilizadas para avaliar tal fenômeno são baseadas no uso de glutamato ou aspartato radioativos ou de medições de glutamato no ambiente intracelular por diversos métodos. No presente estudo nós objetivamos padronizar um método de caracterização do transporte de glutamato por CLAE a partir da doação (quantidade conhecida) e posterior medida de concentrações de glutamato no meio após um período de captação. Desta forma, propomos uma técnica que não utiliza radiação e diminui a perda de informação oriunda do preparo da matriz biológica. MÉTODOS: Em nosso estudo utilizamos como modelo experimental retinas íntegras de embrião de galinha com sete dias de desenvolvimento as quais foram dissecadas em placa de Petri contendo solução de Hank gelado. Após este processo, o curso temporal de captação no tecido foi determinado utilizando 50µM de glutamato em um volume total de 2 mL a 37 0C mantido em estufa de CO2 por 30 minutos sendo realizadas colheitas de 500µl a cada 5 minutos. Para avaliar a captação de glutamato em função da concentração do substrato, foram feitas incubações de glutamato em diferentes concentrações (5, 25, 50, 75, 100, 500, 1000, 1250, 1500, 2000, 5000, micro molar), durante 10 minutos nas mesmas condições descritas acima. A diferença entre o glutamato doado e o que se manteve no meio após o período de captação foi determinado por CLAE acoplado a detector de fluorescência. A análise de regressão não-linear foi utilizada para calcular Vmax e Km usando GraphPad Prism, V5.0. A dosagem de proteína foi feita pelo método de Bradford. RESULTADOS: Nossos resultados mostraram claramente aumento da captação de glutamato até o intervalo de 10 minutos (50% de captação), sendo que a partir deste período observamos uma saturação do sistema de captação. (15’, 20’, 25’ e 30’ minutos). Procuramos também determinar os parâmetros cinéticos da captação de glutamato no tecido como descrito nos métodos. Nossos dados demonstraram que os valores Km e Vmáx para o transporte de glutamato foram de 140.8-184.4 ±10 µM e 18.9-20.5 ± 3.774 µM/min . mg proteínas, respectivamente. CONCLUSÃO: A metodologia utilizada em nosso experimento mostrou-se capaz de reproduzir resultados da cinética de captação de glutamato semelhantes aos descritos na literatura, com a vantagem da não utilização da radioatividade e fácil execução da técnica, mostrando-se uma importante alternativa para este tipo de estudo.